酶的发酵生产

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酶的发酵生产

酶是一种生物催化剂，它具有作用专一性强、催化效率高等特点，能在常温常压和低浓度条件下进行复杂的生化反应。没有酶，就没有了生物体的一切生命活动。虽然酶在数千年前 的酿酒发酵中就已得到了应用，但现代意义上的酶工程是在近几十年才兴起的高科技。酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，它包括酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰与改造，以及酶反应器等方面内容。进入 20 世纪以后，随着微生物发酵技术的发展、酶分离纯化技术的更新，酶制剂的研究得到不断推进并实现了其商业化生产，现已开发出各种类型的酶制剂。工业上直接利用酶制剂时存在一些缺点，如稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应等。为了克服这些缺点，延长酶的使用寿命，提高酶的催化活性，并使其能在生化反应器中反复连续使用，人们发展了酶的固定化技术。酶的固定化是指将酶限制在一定空间内的过程。酶的固定化技术层出不穷，日臻完善。目前在单一酶固定化技术的基础上，又发展了多酶体系的固定化及固定化细胞增殖技术；而固定化酶的研制则推动了新型生物反应器、生物传感器和生物芯片等现代生物电子器件的发展。此外，通过酶的修饰也可提高酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性，使之更适合生产和应用的要求。自 20 世纪 70 年代初基因工程诞生以来，酶工程的发展进入了一个非常重要的时期，科学家仅需将含目的基因的载体转移到宿主细胞内，然后通过发酵就能大量生产人们所需要的酶。近年来发展的蛋白质工程技术则使酶的定向改造成为可能，它不仅可以改变酶的特性，还可按需要设计出某种新型的酶。虽然酶的蛋白质工程还处于起步阶段，但从实际应用上看具有很大的潜力。过去，人们一直认为酶的本质是蛋白质，但自 20 世纪 80 年代发现核酶 (ribozyme，也称核糖核酸质酶，以区别于蛋白质酶)以来，酶是蛋白质的经典概念就被打破了。核酶本身是一种 RNA，但它可以特异性地催化某个反应，特别是识别和剪切 RNA的某个位点，因而极有可能成为病毒基因和生物有害基因表达的专一性抑制剂。随着生物技术的发展，酶工程将引起发酵工业和化学合成工业的巨大变革。

1  酶的发酵生产

     商业用酶来源于动植物组织和某些微生物。传统上由植物提供的酶有蛋白酶、淀粉酶、氧化酶和其他酶，由动物组织提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的凝乳酶。但是，从动物组织或植物组织大量提取的酶，经常要涉及技术上、经济上以及伦理上的问题，使得许多传统的酶源已远远不能适应当今世界对酶的需求。为了扩大酶源，人们正越来越多地求助于微生物。发展微生物作为酶生产的来源主要有以下原因：①微生物生长繁殖快，生活周期短，产量高，单位干重产物的酶比活很高。例如细菌在合适条件下只须 20～30min便可繁殖一代，而农作物至少要几天或几周才能增重一倍。一般来说，微生物的生长速度比农作物快 500 倍，比家畜快 1000 倍。②微生物培养方法简单，所用的原料大都为农副产品，来源丰富，价格低廉，机械化程度高，经济效益高。例如同样生产 lkg结晶的蛋白酶，如从牛胰脏中提取需要 1 万头牛的胰脏，而由微生物生产则仅需数百千克的淀粉、麸皮和黄豆粉等副产品，几天便可生产出来。③微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全。不同环境中的微生物有迥然不同的代谢类型，分解不同的基质有着多样性的酶，可以说一切动植物细胞中存在的酶几乎都能从微生物细胞中找到。④微生物有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种。

实际上，迄今能够用于酶生产的微生物种类是十分有限的。人们偏好于使用长期以来在食品和饮料工业上用作生产菌的微生物。因为要使用未经检验的微生物进行生产，就必须获得法定机构的许可，而获准前必须先进行产品毒性与安全性的评价，整个过程十分费时、费事。基于这个原因，目前大多数的工业微生物酶的生产，都局限于使用仅有的极少数的真菌、细菌或酵母菌。只有找到更加经济可靠的安全试验方法，才能使更多的微生物在工业酶的生产中得到应用。微生物发酵产酶的方法同其他发酵行业类似，首先必须选择合适的产酶菌株，然后采用适当的培养基和培养方式进行发酵，使微生物生长繁殖并合成大量所需的酶，最后将酶分离纯化，制成一定的酶制剂。  

微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条件的控制管理等方面的内容。

1.1培养基

   由于酶是蛋白质，酶的形成也是蛋白质的合成过程，因此微生物产酶的培养基要有利于蛋白质的合成。大多数工业用酶的合成受底物的诱导和分解代谢物的阻遏双重调节，为提高酶产量，应向培养基中添加适量的诱导物，并尽量减少阻遏物的浓度。其次，各种营养物的比例要适当，同时，还应创造一个适于微生物生长和产酶的酸碱度环境。此外，还应注意到有些微生物生长繁殖的培养基不一定有利于酶的合成，也就是说生长繁殖与产酶可能需要两种不同组分的培养基。

    (1)碳源     碳源是微生物细胞生命活动的基础，是合成酶的主要原料之一。工业生产上应考虑原料的价格及来源，通常使用各种淀粉及它们的水解物如糊精、葡萄糖等作为碳源。在微生物发酵中，为减少葡萄糖所引起的分解代谢物的阻遏作用，采用淀粉质材料或它们的不完全水解物比葡萄糖更有利。对于一些特殊的产酶菌需要特殊的碳源才能产酶，如利用黄青霉生产葡萄糖氧化酶，以甜菜糖蜜作碳源时不产生目的酶，而以蔗糖为碳源时产酶量显著提高。

    (2)氮源     氮源可分为有机氮和无机氮，选用何种氮源因微生物或酶种类的不同而异，如用于生产蛋白酶、淀粉酶的发酵培养基，多数以豆饼粉、花生饼粉等为氮源，因为这些高分子有机氮对蛋白酶的形成有一定程度上的诱导作用；而利用绿木霉生产纤维素酶时，应选用无机氮为氮源，因为有机氮会促进菌体的生长繁殖，对酶的合成不利。

    (3)无机盐类    在微生物的发酵生产中，应特别注意有些金属离子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必需的。无机盐一般在低浓度情况下有利于酶产量的提高，而高浓度则容易产生抑制。

    (4)生长因子     生长因子是指细胞生长必需的微量有机物，如维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱等，它们是构成辅酶的必需物质。有些氨基酸还可以诱导或阻遏酶的合成，如在培养基中添加大豆的酒精抽提物，米曲霉的蛋白酶产量可提高约 2 倍。

(5)培养基的 pH     在配制培养基时应根据微生物的需要调节 pH。一般情况下，多数细菌、放线菌生长的最适PH为中性至微碱性，而霉菌、酵母则偏好微酸性。培养基的 pH不仅影响微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有作用。如用米曲霉生产。a-淀粉酶，当培养基的 pH由酸性向碱性偏移时，胞外酶的合成减少，而胞内酶的合成增多。  

1.2酶的发酵生产方式

   酶的发酵生产方式有两种，一种是固体发酵，另一种是液体深层发酵。固体发酵法主要是用于真菌的酶生产，其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在我国已有悠久的历史。这种培养方法虽然简单，但是操作条件不容易控制。随着微生物发酵工业的发展，现在大多数的酶是通过液体深层发酵培养生产的。液体深层培养应注意控制以下条件：

    (1)温度    温度不仅影响微生物的繁殖，而且也明显影响酶和其他代谢物的形成和分泌。一般情况下产酶温度低于生长温度，例如酱油曲霉蛋白合成酶合成的最适温度为 28℃，而其生长的最佳温度为 40℃。

    (2)通气和搅拌     需氧菌的呼吸作用要消耗氧气，如果氧气供应不足，将影响微生物的生长发育和酶的产生。为提高氧气的溶解度，应对培养液加以通气和搅拌。但是通气和搅拌应适当，以能满足微生物对氧的需求为妥，过度通气对有些酶如青霉素酰化酶的生产会有明显的抑制作用，而且在剧烈搅拌和通气下容易引起酶蛋白发生变性失活。

(3)pH 的控制    在发酵过程中要密切注意控制培养基 pH 的变化。有些微生物能同时产生几种酶，可以通过控制培养基的 pH以影响各种酶之间的比例，例如当利用米曲霉生产蛋白酶时，提高 pH有利于碱性蛋白酶的形成，降低 pH则主要产生酸性蛋白酶。  

1.3 提高酶产量的措施

     在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，除了选育优良的产酶菌株外，还可以采用一些与酶发酵工艺有关的措施，例如添加诱导物、控制阻遏物浓度等。

    (1)添加诱导物    对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。诱导物一般可分为三类：①酶的作用底物，例如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物；②酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生；③酶的底物类似物，例如异丙基β—D-硫代半乳糖苷(WIG)对β—半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。其中使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。

    (2)降低阻遏物浓度     微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。例如在-半乳糖苷酶的生产中，只有在培养基中不含葡萄糖时，才能大量诱导产酶。对于受末端产物阻遏的酶，可通过控制末端产物的浓度使阻遏解除，例如，组氨酸的合成途径中，10 种酶的生物合成受到组氨酸的反馈阻遏，若在培养基中添加组氨酸类似物，如 2—噻唑丙氨酸，可使这 10 种酶的产量增加 10 倍。

    (3)表面活性剂    在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机制尚未搞清；可能是由于它的作用改变了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破了胞内酶合成的反馈平衡，提高}酶的产量。此外，有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用，可以提高酶的活力，例如利用霉菌发酵生产纤维素酶，添加 1％的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。

(4)添加产酶促进剂    产酶促进剂是指那些能提高酶产量但作用机制尚未阐明的物质，它可能是酶的激活剂或稳定剂，也可能是产酶微生物的生长因子，或有害金属的螯合剂，例如添加植酸钙可使多种霉菌的蛋白酶和橘青霉的 5，—磷酸二酯酶的产量提高 2～20倍。  

2   酶的分离纯化

    酶的种类繁多，性质各异，分离纯化方法不尽相同，即便是同一种酶，也因其来源不同、酶的用途不同，而使分离纯化的步骤不一样。工业上的用酶一般无需高度纯化，如用于洗涤的蛋白酶，实际上只须经过简单的分离提取即可。而对于食品工业用酶，则需要经过适当的分离纯化，以确保安全卫生。对于医药用酶，特别是注射用酶及分析测试用酶，则须经过高度的纯化或制成晶体，而且绝对不能含有热源物质。酶的分离纯化步骤越复杂，酶的收率越低，材料和动力消耗越大，成本就越高，因而在符合质量要求的前提下，应尽可能采用步骤简单、收率高、成本低的方法。酶的制备流程一般包括破碎细胞、溶剂抽提、离心、过滤、浓缩、干燥这几个步骤，对某些纯度要求很高的酶则需经几种方法乃至多次反复处理。   

     由于酶很不稳定，在提取时容易变性失活，因而提取时应注意：

    (1)温度     整个提纯操作应尽可能在低温下(0-4℃)进行，以防止酶的变性失活或蛋白质水解酶对目的酶的水解(尤其是在有机溶剂或无机盐存在下更应注意)。

    (2)pH     在提纯过程中一般采用缓冲液作为溶剂，防止过酸或过碱。对一特定的酶，溶剂 pH的选择应考虑酶的 pU稳定性以及酶的溶解度。

    (3)盐浓度    因为大多数蛋白质具有盐溶性质，所以在抽提过程中可选用合适浓度的盐溶液以促进蛋白质溶解；但要注意当盐浓度过高时，酶容易变性。

    (4)搅拌    剧烈搅拌容易引起蛋白质变性，提纯中应避免剧烈搅拌和产生泡沫。

(5)微生物污染    酶液是微生物生长的良好培养基，在提纯过程中应尽可能防止微生物对酶的破坏。

3 酶制剂的保存

   酶的保存条件的选择必须有利于维护酶天然结构的稳定性，酶的保存应注意：

(1)温度    酶的保存温度一般在 0～4℃，但有些酶在低温下反而容易失活，因为在低温下亚基间的疏水作用减弱会引起酶的解离。此外，零度以下溶质的冰晶化还可能引起盐分的浓缩，导致溶液的 pH发生改变，从而可能引起酶巯基间连接成为二硫键，损坏酶的活性中心，并使酶变性。   ，

  (2)缓冲液     大多数酶在特定的 pH范围内稳定，偏离这个范围便会失活，这个范围因酶而异，如溶菌酶在酸性区稳定，而固氮酶则在中性偏碱区稳定。

(3)氧化／还原    由于巯基等酶分子基团或 Fe-S 中心等容易为氧化剂所氧化，故这类酶应加巯基或其他还原剂加以保护或在氩气或氮气中保存。

(4)蛋白质的浓度及纯度     一般地说，酶的浓度越高，酶越稳定，制备成晶体或干粉更有利于保存。此外，还可通过加入酶的各种稳定剂如底物、辅酶、无机离子等来加强酶稳定性，延长酶的保存时间。